Flow cytometry เป็นวิธีการวิจัยทางเซลล์วิทยาที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์เซลล์ในเชิงลึก ข้อดีของมันคือช่วยให้คุณศึกษาแต่ละเซลล์เป็นรายบุคคล การวิเคราะห์ประเภทนี้ช่วยประเมินพารามิเตอร์หลายตัวในหลายร้อยเซลล์ในเวลาไม่กี่วินาที ด้วยเหตุนี้ ไซโตฟลูออไรเมทรีจึงถือเป็นหนึ่งในวิธีการวิเคราะห์ที่เร็วและแม่นยำที่สุดในปัจจุบันสำหรับนักวิทยาศาสตร์และแพทย์
หลักการ
หลักการของโฟลว์ไซโตเมตรีขึ้นอยู่กับการวัดการกระเจิงของแสงและการเรืองแสง (เรืองแสง) ของเซลล์ สารแขวนลอยของเซลล์จะถูกส่งผ่านเป็นกระแสน้ำด้วยความเร็วสูงผ่านเซลล์ไซโตมิเตอร์ ซึ่งจะถูกฉายรังสีด้วยเลเซอร์ นอกจากนี้ยังทำการโฟกัสแบบอุทกพลศาสตร์ที่เรียกว่า กลไกของมันคือการไหลจากเซลล์ที่มีอนุภาคที่ศึกษาที่ทางออกไหลเข้าสู่เจ็ตภายนอกซึ่งมีความเร็วสูงกว่า เป็นผลให้อนุภาคถูกจัดเรียงในห่วงโซ่ที่สั่ง
พรีเซลล์จะติดฉลากด้วยสีย้อมเรืองแสงพิเศษ (ฟลูออโรโครม) ขอบคุณพวกเขา แสงเลเซอร์กระตุ้นแสงรอง สัญญาณไฟที่ได้รับลงทะเบียนโดยเครื่องตรวจจับ ต่อจากนั้น ข้อมูลจะถูกประมวลผลโดยใช้อัลกอริธึมของซอฟต์แวร์ที่ให้คุณนับจำนวนเซลล์แต่ละเซลล์ที่แตกต่างกันไปตามเกณฑ์บางประการ
การวิจัยด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบธรรมดามักจะไม่สามารถแยกแยะระหว่างเซลล์ต่างๆ ได้ เนื่องจากมีลักษณะเหมือนกัน Cytofluorimetry สามารถให้ข้อมูลอื่น ๆ (ความสมบูรณ์ของโครงสร้าง DNA) วิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีน การอยู่รอดของเซลล์
เนื่องจากการกระตุ้นของฟลูออโรโครมต้องใช้ลำแสงที่มีความยาวคลื่นต่างกัน รวมถึงเครื่องตรวจจับประเภทต่างๆ การติดตั้งที่ทันสมัยจึงมีช่องการตรวจจับหลายช่อง (ตั้งแต่ 4 ถึง 30) จำนวนตัวปล่อยเลเซอร์สามารถมีได้ตั้งแต่ 1 ถึง 7 อุปกรณ์ที่ซับซ้อนมากขึ้นช่วยให้สามารถศึกษาคุณสมบัติของอนุภาคได้หลายพารามิเตอร์พร้อมกัน
ข้อดีและข้อเสีย
ประโยชน์ของโฟลว์ไซโตเมทรี ได้แก่:
- ความเร็วในการประมวลผลสูง (ลงทะเบียนได้ถึง 30,000 กิจกรรมใน 1 วินาที);
- ความเป็นไปได้ในการศึกษาเซลล์จำนวนมาก (มากถึง 100 ล้านในตัวอย่าง);
- การหาปริมาณความเข้มของแสงฟลูออเรสเซนต์
- วิเคราะห์แต่ละเซลล์;
- ศึกษากระบวนการต่างกันไปพร้อมกัน
- แยกข้อมูลอัตโนมัติตามประชากรเซลล์
- การแสดงผลลัพธ์ที่มีคุณภาพ
คุณสมบัติอีกอย่างของเทคโนโลยีนี้คืออนุภาคที่วิเคราะห์สามารถย้อมด้วยสารละลายฟลูออเรสเซนต์ได้หลายชนิด ด้วยเหตุนี้ การศึกษาแบบหลายพารามิเตอร์จึงเกิดขึ้น
ข้อเสียคือความซับซ้อนของอุปกรณ์ทางเทคนิคและความจำเป็นในการเตรียมตัวอย่างพิเศษ
ไซโตมิเตอร์
อุปกรณ์ประเภทนี้เครื่องแรกมีวางจำหน่ายแล้วในปี 1968 ในเยอรมนี แต่แพร่หลายไปมากในเวลาต่อมา ปัจจุบันอุปกรณ์ที่ทำงานโดยวิธีโฟลว์ไซโตเมตรีสามารถแบ่งออกได้เป็น 2 ประเภทคือ
- อุปกรณ์ที่วัดรังสีเรืองแสง (ความยาวคลื่นตั้งแต่สองช่วงขึ้นไป), การกระเจิงของแสง 10° และ 90° (ตัวตรวจจับการกระเจิงด้านข้างและมุมต่ำ);
- อุปกรณ์ที่นอกเหนือจากการวัดค่าพารามิเตอร์มือถือหลายตัวแล้ว จัดเรียงเป็นกลุ่มโดยอัตโนมัติตามเกณฑ์เหล่านี้
เครื่องตรวจจับการกระจายไปข้างหน้าออกแบบมาเพื่อกำหนดขนาดของเซลล์ และอุปกรณ์กระจายด้านข้างช่วยให้คุณได้รับข้อมูลเกี่ยวกับการปรากฏตัวของเม็ดภายในเซลล์ อัตราส่วนปริมาตรของไซโตพลาสซึมและนิวเคลียส
ไซโตมิเตอร์แบบคลาสสิกซึ่งแตกต่างจากกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงไม่อนุญาตให้มีภาพเซลล์ อย่างไรก็ตาม ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา มีการพัฒนาอุปกรณ์แบบผสมผสานที่สามารถรวมความสามารถของกล้องจุลทรรศน์และไซโตฟลูออริมิเตอร์ได้ พวกเขาจะกล่าวถึงด้านล่าง
ไซโตมิเตอร์การถ่ายภาพ
สำหรับเครื่องมือที่ใช้ในโฟลว์ไซโตเมทรีแบบคลาสสิกคุณลักษณะหนึ่งคือลักษณะเฉพาะ: หากมีการลงทะเบียนเหตุการณ์ที่หายากในประชากรของเซลล์ที่วิเคราะห์แล้ว ไม่มีทางที่จะประเมินว่าสาระสำคัญของพวกมันคืออะไร อนุภาคเหล่านี้อาจเป็นซากเซลล์ที่ตายแล้วหรือเป็นกลุ่มที่หายากก็ได้ ในอุปกรณ์ทั่วไป ข้อมูลดังกล่าวไม่รวมอยู่ในกระแสของเหตุการณ์ทั่วไป แต่เป็นข้อมูลที่มีคุณค่าเฉพาะสำหรับการวิเคราะห์ทางวิทยาศาสตร์และทางคลินิก
โฟลว์ไซโตมิเตอร์รุ่นใหม่ช่วยให้คุณถ่ายภาพเซลล์แต่ละเซลล์ที่ไหลผ่านโซนเครื่องตรวจจับได้ ง่ายต่อการดูโดยคลิกที่พื้นที่ที่เกี่ยวข้องของไดอะแกรมซึ่งแสดงบนจอคอมพิวเตอร์
พื้นที่สมัคร
Flow cytometry เป็นวิธีสากลที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านการแพทย์และวิทยาศาสตร์:
- ภูมิคุ้มกัน;
- เนื้องอก;
- การปลูกถ่าย (การปลูกถ่ายไขกระดูกแดง สเต็มเซลล์);
- โลหิตวิทยา;
- พิษวิทยา;
- ชีวเคมี (การวัดความเป็นกรดภายในเซลล์, การศึกษาพารามิเตอร์อื่นๆ);
- เภสัชวิทยา (สร้างยาใหม่);
- จุลชีววิทยา;
- ปรสิตวิทยาและไวรัสวิทยา;
- oceanology (การศึกษาแพลงก์ตอนพืชเพื่อประเมินสภาพแหล่งน้ำและงานอื่นๆ);
- นาโนเทคโนโลยีและการวิเคราะห์อนุภาคขนาดเล็ก
ภูมิคุ้มกัน
ระบบภูมิคุ้มกันของมนุษย์ประกอบด้วยเซลล์ที่หลากหลาย โฟลว์ไซโตเมทรีในภูมิคุ้มกันวิทยาทำให้สามารถประเมินโครงสร้างและหน้าที่ กล่าวคือ เพื่อดำเนินการ morphofunctionalบทวิเคราะห์
งานวิจัยดังกล่าวช่วยให้เข้าใจธรรมชาติที่ซับซ้อนของภูมิคุ้มกัน ฟีโนไทป์ของเซลล์เปลี่ยนแปลงอันเป็นผลมาจากการกระตุ้นโดยแอนติเจน การพัฒนาของพยาธิสภาพ และปัจจัยอื่นๆ Cytofluorometry สามารถแยกประชากรย่อยของเซลล์ภูมิคุ้มกันในส่วนผสมที่ซับซ้อนและประเมินการเปลี่ยนแปลงทั้งหมดเมื่อเวลาผ่านไป
มะเร็ง
งานที่สำคัญที่สุดอย่างหนึ่งในด้านเนื้องอกวิทยาคือการสร้างความแตกต่างของเซลล์ตามประเภทของเซลล์ หลักการวิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมทรีในเนื้องอกวิทยานั้นมีพื้นฐานมาจากปรากฏการณ์ต่อไปนี้: เมื่อตัวอย่างได้รับการบำบัดด้วยสีย้อมเรืองแสงพิเศษ จะจับกับโปรตีนไซโตพลาสซึม หลังจากแบ่งเซลล์ที่เพิ่มจำนวนอย่างแข็งขัน เนื้อหาจะลดลงครึ่งหนึ่ง ดังนั้นความเข้มของการเรืองแสงของเซลล์จึงลดลงสองเท่า
มีวิธีอื่นๆ ในการตรวจจับเซลล์ที่เพิ่มจำนวน:
- ใช้สีย้อมจับดีเอ็นเอ (โพรพิเดียมไอโอไดด์);
- ใช้ uracil ที่มีป้ายกำกับ;
- การลงทะเบียนระดับที่เพิ่มขึ้นของการแสดงออกของโปรตีนไซคลินซึ่งเกี่ยวข้องกับการควบคุมวัฏจักรของเซลล์