โครมาโตกราฟีเป็นวิธีหนึ่งในการแยกสาร ใช้สำหรับการวิเคราะห์คุณภาพและเชิงปริมาณที่ตามมาของคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของอนุภาคขนาดเล็ก รูปแบบของเทคโนโลยีนี้คือ affinity chromatography แนวคิดในการสร้างความแตกต่างของสารประกอบโปรตีนโดยใช้คุณสมบัติของความสัมพันธ์ระดับโมเลกุลเป็นที่ทราบกันดีอยู่แล้วในทางวิทยาศาสตร์เป็นเวลาหลายทศวรรษ อย่างไรก็ตาม เพิ่งได้รับการพัฒนาในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา หลังจากการแนะนำวัสดุที่มีรูพรุนสูงซึ่งใช้เป็นเมทริกซ์ วิธีนี้ช่วยแก้ปัญหาทั้งด้านการวิเคราะห์ (การแยกสารและการระบุสาร) และปัญหาการเตรียมการ (การทำให้บริสุทธิ์ ความเข้มข้น)
เอสเซนส์
อะฟฟินิตี้โครมาโตกราฟี (จากคำภาษาละติน affinis - “ติดกัน”, “เกี่ยวข้อง”) ขึ้นอยู่กับปฏิสัมพันธ์ของสัมพรรคภาพ ซึ่งเป็นการก่อรูปของพันธะที่จำเพาะสูงระหว่างโมเลกุลตัวเว้นวรรค (ลิแกนด์หรือตัวสัมพันธ์กัน) และโมเลกุลเป้าหมาย กลไกเหล่านี้แพร่หลายในธรรมชาติ (การเชื่อมต่อของผู้ไกล่เกลี่ยหรือฮอร์โมนและตัวรับ แอนติบอดีและแอนติเจน การผสมพันธุ์ของพอลินิวคลีโอไทด์และกระบวนการประเภทอื่นๆ) ในทางการแพทย์ โครมาโตกราฟีแบบสัมพรรคภาพถูกใช้เพื่อวัตถุประสงค์ในทางปฏิบัติตั้งแต่ปี 1951
แยกส่วนประกอบดังนี้:
- สารละลายทำงานที่มีสารที่จะแยกออกมาผ่านตัวดูดซับ
- ลิแกนด์ที่สะสมบนเมทริกซ์ตัวดูดซับจะคงสารนี้ไว้;
- เข้มข้น (สะสม);
- การสกัดสารแยกจากตัวดูดซับโดยการล้างด้วยตัวทำละลาย
วิธีนี้ทำให้คุณสามารถแยกทั้งเซลล์ได้ ความแตกต่างจากโครมาโตกราฟีแบบดูดซับแบบเดิมคือมีการยึดเหนี่ยวทางชีวภาพอย่างแข็งแกร่งของส่วนประกอบที่แยกได้กับตัวดูดซับ ซึ่งมีลักษณะเฉพาะด้วยการเลือกสรรสูง
ตัวดูดซับ
สารต่อไปนี้ใช้เป็นตัวดูดซับ:
- เจลผสมอะกาโรส ซึ่งเป็นโพลีแซ็กคาไรด์ที่ได้จากวุ้น ที่นิยมใช้กันมากที่สุดมี 3 สายพันธุ์: sepharose 4B, CL (cross-linked agarose) และ affi-gel องค์ประกอบหลังเป็นเจลดัดแปลงของ agarose และ polyacrylamide มีความเฉื่อยทางชีวภาพมากกว่า ทนต่อสารเคมีและความร้อนสูง
- ซิลิกา (ซิลิกาเจล).
- แก้ว
- โพลีเมอร์อินทรีย์
เพื่อขจัดสิ่งกีดขวางทางกลระหว่างการสัมผัสลิแกนด์ สารเพิ่มเติมจะถูกใช้แยกมันออกจากตัวพา (เปปไทด์ ไดเอมีน โพลีเอมีน โอลิโกแซ็กคาไรด์)
อุปกรณ์
อุปกรณ์โครมาโตกราฟีแบบสัมพันธ์กันประกอบด้วยหน่วยหลักดังต่อไปนี้:
- ถังเก็บสำหรับเฟสเคลื่อนที่ (ตัวชะ);
- ปั๊มแรงดันสูงสำหรับการจ่ายปานกลาง (ส่วนใหญ่มักจะลูกสูบ);
- กรองสำหรับทำความสะอาดสารชะจากฝุ่น
- อุปกรณ์จ่ายยา;
- คอลัมน์โครมาโตกราฟีสำหรับการแยกส่วนผสม
- เครื่องตรวจจับสำหรับตรวจจับส่วนประกอบที่แยกจากกันออกจากคอลัมน์
- เครื่องบันทึกโครมาโตแกรมและไมโครโปรเซสเซอร์ (คอมพิวเตอร์)
เพื่อลดปริมาณอากาศที่ละลาย ฮีเลียมจะถูกส่งผ่านเฟสเคลื่อนที่ก่อน ในการเปลี่ยนความเข้มข้นของสารชะ มีการติดตั้งปั๊มหลายตัวที่ควบคุมโดยโปรแกรมเมอร์ คอลัมน์โครมาโตกราฟีทำจากสแตนเลส (สำหรับความต้องการที่เพิ่มขึ้นสำหรับความต้านทานการกัดกร่อน) แก้ว (ตัวเลือกสากล) หรืออะคริลิก เส้นผ่านศูนย์กลางของพวกมันอาจแตกต่างกันตั้งแต่ 2 ถึง 70 ซม. ในโครมาโตกราฟีเชิงวิเคราะห์จะใช้ไมโครคอลัมน์ Ø10-150 µm
เพื่อเพิ่มความไวของเครื่องตรวจจับ รีเอเจนต์จะถูกนำเข้าไปในส่วนผสม ซึ่งนำไปสู่การก่อตัวของสารที่ดูดซับรังสีมากขึ้นในรังสีอัลตราไวโอเลตหรือบริเวณที่มองเห็นได้ของสเปกตรัม
วิธีการ
โครมาโตกราฟีของเหลวมี 2 ประเภทหลัก:
- คอลัมน์ซึ่งในคอลัมน์นั้นเต็มไปด้วยเฟสคงที่และส่วนผสมถูกส่งผ่านไปด้วยกระแสสารชะ การแยกจากกันอาจเกิดขึ้นภายใต้แรงกดดันหรือภายใต้แรงโน้มถ่วง
- บางๆ. สารชะจะเคลื่อนที่ไปตามชั้นดูดซับแบบเรียบภายใต้อิทธิพลของแรงของเส้นเลือดฝอย ตัวดูดซับถูกนำไปใช้กับแผ่นแก้ว เซรามิกหรือแกนควอตซ์ ฟอยล์โลหะ
ขั้นตอนหลักของงานได้แก่:
- การเตรียมตัวดูดซับ, การตรึงแกนด์บนตัวพา;
- ป้อนส่วนผสมแยกไปยังคอลัมน์โครมาโตกราฟี;
- การโหลดเฟสมือถือ การรวมองค์ประกอบโดยลิแกนด์
- เปลี่ยนเฟสเพื่อแยกสารที่ถูกผูกไว้
ปลายทาง
Affinity chromatography ใช้เพื่อแยกสารประเภทต่อไปนี้ (ประเภทของลิแกนด์ที่ใช้จะระบุไว้ในวงเล็บ):
- สิ่งที่คล้ายคลึงกันของสารยับยั้งเอนไซม์ ซับสเตรต และโคแฟกเตอร์ (เอ็นไซม์)
- สารชีวภาพที่มีสัญญาณของความแปลกแยกทางพันธุกรรม ไวรัส และเซลล์ (แอนติบอดี);
- คาร์โบไฮเดรตน้ำหนักโมเลกุลสูง โมโนแซ็กคาไรด์โพลีเมอร์ ไกลโคโปรตีน (เลกติน);
- โปรตีนนิวเคลียร์, นิวคลีโอทิลทรานสเฟอเรส (กรดนิวคลีอิก);
- ตัวรับ โปรตีนขนส่ง (วิตามิน ฮอร์โมน);
- โปรตีนที่ทำปฏิกิริยากับเยื่อหุ้มเซลล์ (เซลล์).
เทคโนโลยีนี้ยังใช้เพื่อให้ได้เอ็นไซม์ตรึง และการผูกมัดกับเซลลูโลสทำให้สามารถผลิตอิมมูโนดูดซับได้
โครมาโตกราฟีของโปรตีนที่จับกับดีเอ็นเอ
การแยกโปรตีนที่จับกับดีเอ็นเอทำได้โดยใช้เฮปาริน ไกลโคซามิโนไกลแคนนี้สามารถจับโมเลกุลได้หลากหลาย Affinity chromatography ของโปรตีนในกลุ่มนี้ใช้เพื่อแยกสารเช่น:
- ปัจจัยการเริ่มต้นและการยืดตัวของการแปล (การสังเคราะห์โมเลกุลกรดนิวคลีอิกและโปรตีน);
- restrictases (เอ็นไซม์ที่จดจำลำดับบางอย่างใน DNA ที่มีเกลียวคู่);
- DNA ligases และ polymerases (เอ็นไซม์ที่กระตุ้นการรวมตัวของสองโมเลกุลเพื่อสร้างพันธะเคมีใหม่และเกี่ยวข้องกับการจำลอง DNA);
- สารยับยั้งซีรีนโปรตีเอสที่มีบทบาทสำคัญในกระบวนการภูมิคุ้มกันและการอักเสบ
- ปัจจัยการเจริญเติบโต: ไฟโบรบลาสต์, ชวานน์, บุผนังหลอดเลือด;
- โปรตีนของเมทริกซ์นอกเซลล์
- ตัวรับฮอร์โมน;
- ไลโปโปรตีน.
ศักดิ์ศรี
วิธีนี้เป็นวิธีที่เฉพาะเจาะจงที่สุดวิธีหนึ่งสำหรับการแยกสารประกอบปฏิกิริยา (เอนไซม์และมวลรวมที่ใหญ่กว่า - ไวรัส) อย่างไรก็ตาม ไม่เพียงแต่ใช้เพื่อแยกสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพเท่านั้น
การตรวจหาแอนติบอดีในปริมาณเล็กน้อย การประเมินเชิงปริมาณของกรดโพลิอะเดนิลิก การกำหนดมวลโมเลกุลของดีไฮโดรจีเนสอย่างรวดเร็ว การกำจัดสารมลพิษบางชนิด การศึกษาจลนศาสตร์ของการกระตุ้นรูปแบบทริปซินที่ไม่ได้ใช้งาน โครงสร้างโมเลกุลของมนุษย์ interferons - นี่ไม่ใช่รายการทั้งหมดของการศึกษาที่ใช้ความสัมพันธ์กัน โครมาโตกราฟี การใช้งานในคลินิกเกิดจากข้อดี เช่น
- ความสามารถในการทำความสะอาดที่มีประสิทธิภาพโปรตีน พอลิแซ็กคาไรด์ กรดนิวคลีอิก คุณสมบัติทางกายภาพและทางเคมีแตกต่างกันเล็กน้อย และสูญเสียกิจกรรมในระหว่างการไฮโดรไลซิส การทำให้เสียสภาพ และการบำบัดประเภทอื่นๆ ที่ใช้ในวิธีอื่นๆ
- ความเร็วของการแยกสาร ธรรมชาติแบบไดนามิกของกระบวนการ
- ไม่จำเป็นต้องทำให้บริสุทธิ์ด้วยเอนไซม์พิเศษและการทำให้เป็นเนื้อเดียวกันของไอโซไซม์เพื่อกำหนดค่าคงที่ของการแตกตัว
- แยกสารได้หลากหลาย
- การบริโภคลิแกนด์ต่ำ
- ความเป็นไปได้ของการแยกสารในปริมาณมาก
- กระบวนการย้อนกลับของโมเลกุลทางชีววิทยาที่จับต้องได้
เทคนิคนี้สามารถใช้ร่วมกับเทคนิคอื่นๆ เพื่อกำหนดสนามเพิ่มเติม (แรงโน้มถ่วง, แม่เหล็กไฟฟ้า) ซึ่งจะทำให้คุณสามารถเพิ่มความสามารถทางเทคนิคของโครมาโตกราฟี
วิศวกรรมเอนไซม์
ด้วยวิธีนี้ การพัฒนาเชิงรุกของเทคโนโลยีชีวภาพสาขาใหม่ - วิศวกรรมเอ็นไซม์เริ่มต้นขึ้น
โครมาโตกราฟี Affinity สำหรับการแยกเอนไซม์มีข้อดีดังต่อไปนี้:
- ได้เอ็นไซม์ในปริมาณมากโดยใช้เวลาน้อยลงส่งผลให้ราคาลดลง
- การตรึงเอ็นไซม์สามารถขยายขอบเขตของการประยุกต์ใช้ในยาและอุตสาหกรรมอย่างมีนัยสำคัญ
- ความสัมพันธ์ของเอ็นไซม์กับตัวรองรับของแข็งที่ไม่ละลายน้ำทำให้สามารถศึกษาอิทธิพลของสภาพแวดล้อมจุลภาคและทิศทางของปฏิกิริยา ซึ่งมีบทบาทสำคัญในกระบวนการทางธรรมชาติและทางสรีรวิทยา
