PCR หรือปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส เป็นเทคนิคทางห้องปฏิบัติการที่ซับซ้อนซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในด้านการแพทย์และวิทยาศาสตร์อื่นๆ การวินิจฉัย PCR ในครั้งเดียวกลายเป็นความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์อย่างแท้จริง
รายละเอียด
PCR เชิงปริมาณเป็น PCR แบบเรียลไทม์ประเภทหนึ่ง
เป็นที่เข้าใจกันว่าเป็นตัวแปรของ PCR ซึ่งจลนพลศาสตร์ของปฏิกิริยาจะถูกบันทึกอย่างต่อเนื่อง ซึ่งทำให้สามารถประเมินเนื้อหาของลำดับนิวคลีโอไทด์ของ DNA จำเพาะในส่วนผสมของโมเลกุลที่ซับซ้อนได้
วิธีการ PCR เชิงปริมาณจะกล่าวถึงในรายละเอียดเพิ่มเติมด้านล่าง
สาระสำคัญของการวิเคราะห์
วิธีการทางวัฒนธรรมและทางซีรั่มมักใช้ในการวินิจฉัยการติดเชื้อ ภายใต้ข้อแรก แอนติบอดีต่อเชื้อก่อโรคในเลือดจะถูกกำหนด ประการที่สอง วัสดุชีวภาพที่นำมาจากผู้ป่วยจะใช้ในการหว่านอาหารเฉพาะซึ่งเอื้ออำนวยต่อการเจริญเติบโตของอาณานิคมของเชื้อโรค การวินิจฉัยในทั้งกรณีอาจเป็นวันหรือสัปดาห์
การตรวจ PCR สามารถทำได้โดยใช้วัสดุชีวภาพต่างๆ ที่ได้รับจากผู้ป่วย เลือดและสื่อทางพยาธิวิทยา สรีรวิทยา และชีวภาพอื่นๆ และของเหลวทำหน้าที่เป็นตัวอย่าง ถ่าย PCR หรือปัสสาวะก็ได้
การติดเชื้อที่ผิดปกติและไวรัสมักถูกวินิจฉัยโดย PCR เชิงปริมาณ เนื่องจากอาจวินิจฉัยได้ไม่ง่ายเนื่องจากลักษณะเฉพาะของกระบวนการทางพยาธิวิทยาที่กระตุ้นโดยพวกเขา ในการตรวจสอบการติดเชื้อดังกล่าว ต้องใช้เวลาในระหว่างที่ร่างกายผลิตแอนติบอดี้ โดยพิจารณาจากวิธีทางซีรั่มวิทยา แต่นี่เป็นสิ่งที่ยอมรับไม่ได้ในบางกรณี
วิธีดำเนินการ
PCR method - การตรวจหาการติดเชื้อในห้องปฏิบัติการในตัวอย่างที่แยกได้จากผู้ป่วย (ในหลอดทดลอง)
ในการทำปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส จำเป็นต้องใช้ชุดน้ำยาพิเศษ
นำวัสดุที่ใช้ทดสอบไปใส่ในหลอดทดลองที่มีสารทำปฏิกิริยา หลอดทดลองถูกวางไว้ในอุปกรณ์พิเศษ - แอมพลิฟายเออร์ PCR ซึ่งออกแบบมาเพื่อขยาย (เพิ่มจำนวน) ของ RNA หรือชิ้นส่วน DNA ที่ต้องการ แอมพลิฟายเออร์ PCR ทำงานในโหมดวัฏจักร ในทุกรอบ หากตัวอย่างมีลำดับอาร์เอ็นเอหรือดีเอ็นเอของเชื้อโรค สำเนาของอนุภาคของกรดนิวคลีอิกเหล่านี้จะสะสมในสารละลายมากขึ้นเรื่อยๆ คุณสามารถระบุการปรากฏตัวของเชื้อโรคและปริมาณในตัวอย่างได้
ประเภทของ PCR
การวิเคราะห์เชิงคุณภาพโดย PCR ช่วยให้คุณได้ผลลัพธ์ดังต่อไปนี้:
- เชิงลบ เมื่อไม่พบเชื้อโรคที่สนใจในตัวอย่าง;
- บวก หากพบลำดับในตัวอย่างที่เป็นลักษณะของเชื้อโรคบางชนิด
ด้วยผล PCR เชิงบวก เราสามารถพูดได้อย่างแม่นยำ 95% เกี่ยวกับการปรากฏตัวของการติดเชื้อที่วินิจฉัย ในขณะเดียวกัน ความแม่นยำของชุด PCR ที่ใช้เพื่อการวินิจฉัยถึง 100%
โดยปกติ 5% ของผลลัพธ์ที่ไม่ถูกต้องจะถูกกำหนดโดยปัจจัยมนุษย์ ตัวอย่างเช่น การละเมิดเทคนิคการวิเคราะห์และการจัดเก็บรีเอเจนต์สามารถลดความแม่นยำของการศึกษาลงได้อย่างมาก
PCR เชิงปริมาณกำหนดแนวคิดของปริมาณไวรัส เป็นไปได้ที่จะระบุจำนวน DNA ของเชื้อก่อโรคในตัวอย่างที่นำมาจากผู้ป่วย
ความรุนแรงของการติดเชื้อเป็นสัดส่วนโดยตรงกับจำนวนที่เพิ่มขึ้น คุณยังสามารถกำหนดความสำเร็จของการบำบัดเพื่อลดปริมาณไวรัสได้
ยื่นขอ PCR biomaterial
การตรวจ PCR เชิงปริมาณดำเนินการที่คลินิก ส่วนใหญ่ในตอนเช้า ในระหว่างการไปพบแพทย์ ผู้ป่วยจะได้รับแจ้งว่าต้องทำอย่างไร: ขูด รอยเปื้อน ปัสสาวะหรือเลือด PCR สามารถตรวจจับเชื้อโรคโดยไม่คำนึงถึงระดับการปนเปื้อนของวัสดุ
สำหรับการวิเคราะห์ในเชิงบวก ในทางทฤษฎี จำเป็นต้องมีเชื้อโรคเพียงตัวเดียวในตัวอย่าง ในทางปฏิบัติ พวกเขาพยายามสร้างเงื่อนไขที่เอื้ออำนวยมากยิ่งขึ้น มีคำแนะนำสำหรับสิ่งนี้:
- ถ้าขูดหรือเช็ดออกจากอวัยวะเพศอวัยวะ คุณต้องงดการมีเพศสัมพันธ์สามวันก่อนการศึกษา
- คุณไม่สามารถล้างด้วยยาต้านแบคทีเรียหรือล้างตัวเองก่อนการวิเคราะห์
- สามชั่วโมงก่อนที่จะละเลงจากท่อปัสสาวะ คุณต้องอดทนและไม่ล้างลำไส้ของคุณ
บริจาคเลือดอย่าทำตามกฎ
ผลการวิเคราะห์ PCR เชิงปริมาณมีการตีความอย่างไร
การประเมินเชิงปริมาณของผลลัพธ์ที่ได้รับ
ในสถานการณ์ทางคลินิกจำนวนหนึ่ง ปัญหาของประสิทธิผลของการรักษาและ / หรือการเปลี่ยนแปลงของกระบวนการทางพยาธิวิทยาปรากฏขึ้น คำถามดังกล่าวมีความเกี่ยวข้องอย่างยิ่งเมื่อตรวจผู้ที่ติดเชื้อเรื้อรัง (ไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์, ไวรัสตับอักเสบบีและซี) เมื่อทำการวินิจฉัย จะขึ้นอยู่กับความจริงที่ว่าการสะสมของแอมพลิคอน (ผลิตภัณฑ์ PCR) เป็นสัดส่วนกับการมีอยู่ของสำเนาของยีนที่ต้องการในตัวอย่างที่วิเคราะห์
แน่นอน เมื่อคำนึงถึงผลลัพธ์ของ PCR เชิงปริมาณนั้นทำได้โดยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสด้วยการศึกษาความเข้มของสัญญาณ PCR พิเศษ นอกจากนี้ ข้อกำหนดเบื้องต้นสำหรับการประเมินเชิงปริมาณที่ถูกต้องของผลลัพธ์ที่ได้คือตัวอย่างกลุ่มควบคุมที่เชื่อถือได้ในเชิงบวกซึ่งมีสำเนาจำนวนที่ทราบของยีนที่ต้องการ (ตัวอย่างเช่น ยีนตับอักเสบซีหนึ่งพันชุดสำหรับปฏิกิริยา PCR หนึ่งปฏิกิริยา) การเจือจางแบบอนุกรมหลายครั้งของการควบคุมเชิงปริมาณช่วยให้สามารถสร้างเส้นโค้งการสอบเทียบและใช้ในการประเมินเนื้อหาของจีโนโคปีทางคลินิกในตัวอย่างทางคลินิก
ในนิยามของ PCR เชิงปริมาณ ความสำเร็จที่สำคัญคือการสร้างสรรค์โพรบ DNA เรืองแสงที่เติมลงในส่วนผสมของปฏิกิริยาพร้อมกันกับไพรเมอร์อย่างง่าย และช่วยให้คุณติดตามกระบวนการ PCR ได้ทันเวลา นั่นคือ PCR แบบเรียลไทม์
วิธีการของ TaqMan หมายถึงการสังเคราะห์โพรบดีเอ็นเอเรืองแสงที่จำเพาะต่อส่วนตรงกลางของแอมพลิคอนและมีฉลากสองอันที่ปลาย หนึ่งในนั้นคือฉลากเรืองแสง อันที่สองคือโมเลกุลดับสำหรับการเรืองแสงนี้
อุปกรณ์พิเศษซึ่งเป็นลูกผสมของฟลูออริมิเตอร์และเทอร์โมบล็อก-แอมพลิฟายเออร์ จะทำการวัดค่าการเรืองแสงคงที่ในแต่ละหลอดทดลอง (หลักการ PCR แบบเรียลไทม์) หลังจาก PCR 20-40 รอบแล้ว จะได้กราฟแต่ละเส้นสำหรับแต่ละตัวอย่าง จำนวนสำเนาของยีนที่ต้องการซึ่งมีอยู่ในตัวอย่างทดสอบสามารถคำนวณได้จากกราฟการปรับเทียบด้วยตัวอย่างควบคุม
นอกจากนี้ คุณลักษณะที่สำคัญของการนำ PCR ไปใช้โดยวิธีเรืองแสงก็คือ ไม่จำเป็นต้องเปิดหลอดที่มีส่วนผสมของ PCR เมื่อคำนึงถึงผลลัพธ์ด้วย ซึ่งช่วยลดความเป็นไปได้ที่ห้องจะปนเปื้อนด้วยผลิตภัณฑ์ขยายเสียง และไม่จำเป็นต้องจัดสรรพื้นที่ทำงานพิเศษสำหรับอิเล็กโตรโฟรีซิส
การถอดเสียง PCR เชิงปริมาณแสดงอะไร
กำลังค้นพบอะไร
ด้วยวิธีการเช่น PCR เชิงปริมาณ จะพบการเปลี่ยนแปลงเชิงคุณภาพในยีน: การแทรก การลบ และการกลายพันธุ์ของจุด แต่ด้วยความผิดปกติทางพันธุกรรมบางอย่าง อาการที่เกี่ยวข้องจะปรากฏขึ้นเพื่อตอบสนองต่อการเปลี่ยนแปลงในเนื้อหาของยีนบางตัว
ขอบคุณครับการวิเคราะห์เชิงปริมาณให้ผลลัพธ์ที่เป็นตัวเลข ส่วนใหญ่มักจะอยู่ใน IU / ml ซึ่งหมายความว่าในตัวอย่างทดสอบหนึ่งมิลลิลิตร จะพบสำเนา RNA หรือ DNA ของเชื้อโรคจำนวนหนึ่งซึ่งวัดในหน่วยสากล
การวินิจฉัยความรุนแรงของการติดเชื้อขึ้นอยู่กับขนาด เลือดมักจะได้รับการทดสอบเพื่อระบุปริมาณไวรัส เนื่องจากไวรัสสามารถเคลื่อนที่ได้อย่างอิสระในเลือดระหว่างการเจ็บป่วย
คุณสมบัติ
PCR เชิงปริมาณในการตรวจเลือดมีคุณสมบัติสองอย่าง
- การวิเคราะห์จะดำเนินการต่อหน้าไพรเมอร์หรือดีออกซีไรโบนิวคลีโอไซด์ไตรฟอสเฟต ซึ่งติดฉลากด้วยฉลากเรืองแสงหรือสารกัมมันตภาพรังสีเพื่อระบุเนื้อหาของผลิตภัณฑ์ PCR ที่เกิดขึ้นได้อย่างแม่นยำ
- ในกระบวนการ PCR ให้ยุติปฏิกิริยาก่อนกำหนดก่อนที่ผลิตภัณฑ์ PCR จำนวนมากจะปรากฏขึ้น เนื่องจากในขั้นตอนสุดท้ายของการทำให้อิ่มตัว เมื่อมีผลิตภัณฑ์ PCR จำนวนมาก ทั้งตัวเอนไซม์เองและสารตั้งต้นทำหน้าที่เป็นตัวเชื่อมโยงที่จำกัดของปฏิกิริยานี้ การสิ้นสุดของวัฏจักร PCR ถัดไปภายใต้เงื่อนไขดังกล่าวจะไม่มีลักษณะเฉพาะด้วยการเพิ่มผลิตภัณฑ์ PCR เป็นสองเท่าอีกต่อไป ความแตกต่างเชิงปริมาณที่ไม่มีนัยสำคัญระหว่างตัวอย่างต่างๆ จะถูกปรับระดับ ซึ่งค่อนข้างกำหนดไว้อย่างชัดเจนในระยะแรกหลังจากผ่านชุดของวัฏจักรปฏิกิริยา.
ค่าวินิจฉัย PCR
การวิจัย PCR มีค่าใช้จ่าย ซึ่งขึ้นอยู่กับชนิดของการติดเชื้อที่จะทำการทดสอบ วิธีการวิเคราะห์และวัสดุในการทดสอบ เพื่อตรวจสอบการติดเชื้อ คุณจะต้องให้ภายใน200-800 รูเบิล มีการบวกค่าธรรมเนียมสำหรับการใช้วัสดุชีวภาพ - ประมาณ 400 รูเบิล
